大肠杆菌检测
大肠杆菌病（colibaciliosis）是致病性大肠杆菌引起的一类疾病的总称，主要引起肠炎、肠毒血症及败血症等病症，影响动物的生长甚至导致死亡。致病性大肠杆菌与肠道正常寄居的非致病性大肠杆菌在形态、染色反应、培养特性及生化反应等方面很难区分，但其抗原构造不同，可以根据O（菌体）抗原、K（荚膜）抗原和H（鞭毛）抗原的不同进行血清学鉴定。
一
检测诊断标准
表1 大肠杆菌检测诊断标准（现行）
二
流行病学
病猪和带菌猪是本病的主要传染源，通过粪便排出病菌，散布于外界，污染饲料、母猪的乳头和皮肤。当仔猪吮乳或饮食时，经消化道感染。各种年龄的猪均可发生，但仔猪最易感。本病一年四季都可发生，但以冬春季节多发，多呈散发和地方流行性。
三
临床症状与病理变化
仔猪感染致病性大肠杆菌时的生长期和病原菌血清型不同，临床病变常见于仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病三种类型。猪感染致病性大肠杆菌，根据发病日龄和临床症状可分为仔猪黄痢、仔猪白痢、仔猪水肿病。仔猪黄痢：本病多发于1~7日龄仔猪。以腹泻为主，病猪初排黄色稀便，后排半透明黄色液体，有腥臭味，含有凝乳小块。病仔猪被毛粗乱无光，偶有呕吐，并迅速消瘦，脱水死亡。主要病变是肠道膨胀，有多量黄色液状内容物和气体，肠系膜淋巴结出血，肝、胃有坏死灶。仔猪白痢：本病一般发生于10~30日龄仔猪。病猪突然发生腹泻，粪便呈乳白色、灰白色或黄白色，常混有黏液，有特殊腥臭味。主要病变是胃肠道卡他性炎症，肠系膜淋巴结轻度肿胀。仔猪水肿病：本病多发于断奶仔猪。突然精神沉郁、不食，口流白沫。病猪眼睑、头部、下颌见水肿，严重的可能全身水肿，病初兴奋、转圈，共济失调；后期卧地不起，呼吸窘迫，最后昏迷。全身多处组织器官水肿，胃壁及肠系膜水肿，小肠黏膜弥漫性出血，淋巴结水肿、充血、出血。
四
实验室检测诊断
（一）病原学检测诊断
1.细菌分离培养将采集肠内容物样品、拭子或其他疑似感染病料接种到改良麦康凯或伊红美蓝等其他选择性培养基上培养18~24h后，在伊红美蓝琼脂培养基为黑色带金属光泽的菌落；一般肠出血性大肠杆菌的O157:H7在含山梨醇的麦康凯培养基上长成无色的菌落，而其他的大肠杆菌则为粉红色；肠侵袭性大肠杆菌与志贺菌十分相似。根据菌落特点进行初步进行初步诊断，不能区分可进一步生化试验。
2.镜检分离菌株经革兰氏染色后，在油镜下可观察到分离菌株为革兰氏阴性两短钝圆、中等大小、多单个存在。
3.生化鉴定根据自营养琼脂平板上挑取单个菌落，进行吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验（四种生化反应试验简称为IMViC）。若待鉴定菌株IMViC结果++–，则为典型大肠杆菌；若IMViC结果–++，则为典型产气肠杆菌；若IMViC结果++-+，则为典型中间型大肠杆菌。
（二）血清学检测诊断1.酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是用于检测食源性病原体的最广泛使用的方法之一。它具有灵敏度高，使用方便，特异性强、灵敏等优点。Padhye 采用单克隆抗体ELISA 检测大肠杆菌 O157∶H7。但是对于检测所有血清型的大肠杆菌需要广谱抗体，我国仅中国兽药监察所针对大肠杆菌K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）抗原开发了ELISA试剂盒，可用于幼畜大肠杆菌的检测。
2.免疫磁性分离（IMS）IMS是使用免疫磁珠（IMB）作为捕获试剂分离和鉴定微生物的方法。如将EHECO157∶H7 特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上，然后利用抗原抗体的反应特性将样品中的大肠杆菌 EHEC O157∶H7 富集起来，捕获样本中的 EHEC O157∶H7后，在磁场作用下分离磁珠，可起到浓缩纯化效果，大大提高检测灵敏度。
3.免疫胶体金标记技术（ICS）ICS可分为斑点免疫层析法（DICA）和斑点金免疫渗滤法（DIGFA）两种。DICA利用的是免疫色层技术。在检测卡上，将胶体金标记的兔抗O157抗体和兔抗羊IgG抗体分别固定在膜上下，作为测试带和质控带。样品增菌液滴至加样孔膜上并展开，若含有EHEC O157∶H7会集合到检测带处形成抗原-抗体复合物，呈现可见的红色带，而羊IgG结合到质控带呈现红色，该法多用于EHEC O157∶H7的初筛，常与免疫磁珠分离法结合使用。DIGFA 是预先在硝酸纤维素膜的中央滴加纯化的抗O157∶H7的抗体，待吸附干燥后，依次滴入待检菌液、胶体金标记O157∶H7抗体及洗涤液，膜中央呈红色斑点者为阳性。
（三）分子检测诊断方法1.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种体外快速扩增目标序列片段的技术。该方法具有其操作简单、特异性强、灵敏度高等优点。自从 PCR 发展以来，已开发出多种 PCR 方法检测大肠杆菌，包括多重 PCR 和荧光定量 PCR。大肠杆菌基因扩增的引物序列及片段大小见表2。
表2大肠杆菌基因扩增的引物序列及片段大小
2.环介导等温核酸扩增（LAMP）LAMP是一种在恒定温度下以高特异性和快速扩增核酸的技术。LAMP简单且易于操作，对仪器设备要求低，已被广泛应用于食源性疾病的检测。《SN/T 3306.14-2017国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》针对大肠杆菌O157:H7特有的rfbE基因序列设计3对引物，见表3，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶进行扩增，结果可通过观察颜色进行判定。
表3 大肠杆菌LAMP检测诊断的引物序列
3.多重PCR引起腹泻的大肠杆菌主要有5种，分别是肠产毒性大肠杆菌（ETEC），肠致病性大肠杆菌（EPEC），肠侵袭性大肠杆菌（EIEC），肠出血性大肠杆菌（EHEC）和肠集聚性大肠杆菌（EAEC），这五种致病性大肠杆菌分别有不同的血清型，如O157:H7属于EHEC，临床上为了快速鉴定分离到的肠源大肠杆菌是否具有致病性，通常采用多重PCR鉴定大肠杆菌的毒力基因，然后根据检测到的不同毒力基因对分离到的大肠杆菌进行分类，但不同的大肠杆菌有不同的表型，引物见表4，分型见表5。
表4 致泻大肠埃希氏菌检测诊断的引物
表5 5类致泻性大肠杆菌基因分型情况
中科基因大肠杆菌病检测诊断能力
中科基因可以通过对细菌进行分离鉴定、聚合酶链式反应（PCR）等方法进行大肠杆菌病原检测诊断，使用药敏试验进行敏感药物筛选。中科基因是国内通过CMA认证的第三方兽医检测检验独立实验室连锁机构，有能力出具具有社会证明性作用的诊断评估报告，具有法律效力。
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